NMY51 感受態細胞培養操作規程：

一．培養基及培養凍存條件準備：
1）準備RPMI-1640培養基(RPMI-1640：GIBCO，貨號21875-091)，90%；優質胎牛血清，10%。
2）培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配，液氮儲存。
二．細胞處理：
1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養基的培養瓶中培養過夜。*天換液并檢查細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。
對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。

注意事項：
1. 感受態細胞*在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內加入目標DNA，不可在冰中放置時間過長，長時間存放會降低轉化效率。 
2. 混入質粒或連接產物時應輕柔操作。 
3. 轉化高濃度的質粒或高效率的連接產物可相應減少最終用于涂板的菌量。
同一批感受態細胞，用含目的片段的T載體質粒轉化（陽性對照）能長出密密麻麻的菌落，而用另一種載體和目的片段的連接產物轉化，卻一個菌都沒長出來，重復了三次都這樣。請問這是感受態細胞的制作不過關，還是連接出了問題？哪個可能性大些？
答：應該是連接的問題。所有連接反應建議同時轉化酶切后的質粒作為另一個陰性對照，確定酶切是否完全。同時連接前請確定質粒和片段濃度達到最小連接量的要求。